文獻解讀
TurboID之鑒定胞內互作蛋白:篩選靶標蛋白的潛在互作蛋白
研究者通過構建靶標蛋白-TurboID融合表達的實驗技術手段,將與靶標蛋白潛在結合蛋白質進行生物素標記,并通過鏈素親和素磁珠富集生物素標記的蛋白,結合質譜和定量蛋白質組學,確定了靶標蛋白CRBN的結合互作蛋白。
研究者們通過TurboID及定量蛋白質組學的方法,在CRBN 相互作用組中鑒定出了組蛋白去甲基化酶 KDM5C,并表明KDM5C 能夠與 CRBN 結合并使其穩定,而且 KDM5C 抑制劑對 CRBN 沒有影響,表明 KDM5C 以酶活性非依賴的方式調節 CRBN。
2025年1月,來自蘇州大學的周亮老師團隊,在期刊Cell Mol Biol Lett(生物學1區,IF: 10.2,Top期刊)上發表文章The histone demethylase KDM5C enhances the sensitivity of acute myeloid leukemia cells to lenalidomide by stabilizing cereblon。該研究通過構建CRBN-TurboID融合表達載體,轉染至HEK293T細胞中過表達,富集出與CRBN存在潛在相互作用的蛋白,接著通過蛋白質組學的方式,驗證CRBN與相互作用蛋白KDM5C的作用方式,結果證明,組蛋白去甲基化酶KDM5C通過非酶活依賴的方式調控CRBN的蛋白穩定性。
1. CRBN互作蛋白的篩選
研究者首先構建了CRBN-TurboID的融合表達質粒,將其轉染至HEK293T細胞中,通過生物素富集到NAC1、PICALM和組蛋白去甲基酶KDM5C作為特定的CRBN相互作用蛋白,并通過共沉淀的方式進行了驗證,且在AML細胞系THP1和NB4中,同樣驗證了內源性KDM5C可以結合CRBN。
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2. KDM5C與CRBN互作方式鑒定
研究者通過構建siRNA,在多細胞系中確定KDM5C降低,導致CRBN蛋白水平下降且不影響其mRNA水平,并通過泛素-蛋白酶體系統抑制劑MG132和自噬-溶酶體途徑抑制劑Baf A1抑制細胞內兩種主要降解途徑,發現其對KDM5C-CRBN并無顯著影響,研究者通過篩選大量的胞內信號通路抑制劑,確定Neddylation抑制劑MLN4924穩定提升KDM5C表達,并通過CHX實驗確定了這一想法,且通過添加KDM5C抑制劑CPI-455、KDM5-IN-1,表明KDM5C不依賴酶活途徑穩定CRBN的表達。
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小結
本研究通過構建在HEK293T細胞內轉染CRBN-TurboID融合表達質粒,無差別篩選與CRBN結合互作的蛋白,最終篩選出組蛋白去甲基化酶KDM5C,并通過一系列的蛋白檢測方法,在多個AML細胞系內驗證了KDM5C以非酶活依賴的方式促進CRBN的穩定性。
參考文獻
1. Zou, L., D. Cao, Q. Sun, W. Yu, B. Li, G. Xu, and L. Zhou, The histone demethylase KDM5C enhances the sensitivity of acute myeloid leukemia cells to lenalidomide by stabilizing cereblon. Cell Mol Biol Lett, 2025. 30(1): p. 14, http://doi/ 10.1186/s11658-025-00697-8


