研究者通過TurboID的實驗技術手段，捕獲并富集源自與人內皮細胞和星形膠質細胞共培養的球體內人腦周細胞的分泌蛋白，結合質譜和多重免疫測定，確定了不同處理條件下周細胞分泌的蛋白質。

腦內細胞通訊對于維持穩態和對病理觸發因素如缺氧做出有效反應至關重要，然而，對分泌分子的精確組成和動態釋放的全面理解一直難以實現。為了克服這些局限性，我們利用了非毒性生物素連接酶TurboID的潛力：1. 使用TurboID進行分泌組分析，并優化蛋白質回收方法，2. 利用該方法表征周細胞在血腦屏障中對缺氧刺激的特定信號，3. 表征單周細胞培養和共培養分泌組之間的差異。這項研究對識別旨在調節與缺氧相關的腦部病變中的微血管信號的目標治療策略具有重要意義。

2024年5月，來自瑞典隆德大學的Gesine Paul教授團隊，在期刊Mol Cell Proteomics （生化研究方法1區，IF:5.5，Top期刊）上發表文章Pericyte-Specific Secretome Profiling in Hypoxia Using TurboID in a Multicellular in Vitro Spheroid Model。該研究通過構建人腦周細胞、人腦微血管內皮細胞與星形膠質細胞的球形共培養體系，并通過構建人腦周細胞的內質網錨定TurboID，鑒定了缺氧條件、單獨培養條件及共培養條件下，人腦周細胞分泌蛋白的差異。該研究對細胞特異性分泌組分析的方法學方面提供了獨特的見解。

1. 共培養體系中TurboID 活性和分泌蛋白的生物素化

研究者首先鑒定了TurboID在周細胞內的活性，通過免疫熒光實驗，證實周細胞都表達了TurboID，并且與ER標記物 calnexin 共定位，接著，研究者通過收集細胞培養液上清，明確了只有在存在外源生物素的情況下表達TurboID連接酶才會發生蛋白質標記。接著，研究者通過構建TurboID-人周細胞穩轉表達細胞，再與人腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞組成球體共培養體系，通過免疫印跡實驗，研究者發現常氧和缺氧環境中均觀察到了強效的鏈霉抗生物素蛋白印跡信號。

2. 分泌蛋白的蛋白質組學研究

研究者將不同條件下的周細胞分泌蛋白富集起來，通過LC-MS/MS對各組周細胞的分泌蛋白進行鑒定。

小結

本研究通過構建周細胞內的內質網錨定TurboID，將周細胞內的所有分泌蛋白進行無差別的生物素標記，再通過鏈素親和素將所有的生物素標記蛋白富集起來，進行LC-MS/MS，鑒定出周細胞的分泌蛋白，為血腦屏障細胞間互作導致的分泌蛋白鑒定提供了新的見解和實驗方法。

參考文獻

1. Enstrom, A., R. Carlsson, C. Buizza, M. Lewi, and G. Paul, Pericyte-Specific Secretome Profiling in Hypoxia Using TurboID in a Multicellular in Vitro Spheroid Model. Mol Cell Proteomics, 2024. 23(6): p. 100782, http://doi/ 10.1016/j.mcpro.2024.100782