肝細胞癌（HCC）是全球范圍內惡性程度極高的腫瘤之一，腫瘤代謝重編程是其惡性進展的核心驅動力，其中缺氧誘導因子- 1α（HIF-1α）介導的糖代謝異常亢進，為肝癌細胞快速增殖、適應腫瘤微環境提供了關鍵能量支撐。HIF-1α的活性與β- 連環蛋白（β-catenin）通路密切關聯，而ICAT作為β-catenin的天然抑制因子，其與 β-catenin的相互作用平衡直接調控通路活性，進而深刻影響HIF-1α介導的糖代謝網絡。當前肝癌治療仍面臨耐藥、復發率高等難題，針對代謝關鍵節點的精準干預成為突破治療瓶頸的迫切需求。

今天和大家分享一篇關于鴉膽子素D（Bruceine D）通過阻斷ICAT/β-catenin相互作用，抑制肝細胞癌中HIF-1α介導的糖代謝的研究文章。該文章于2021年5月發表在Acta Pharm Sin B雜志上，標題為“Bruceine D inhibits HIF-1α-mediated glucose metabolism in hepatocellular carcinoma by blocking ICAT/β-catenin interaction”。

01. 研究思路

本研究針對肝細胞癌（HCC）缺氧微環境下HIF-1α介導糖代謝重編程的臨床難題，以天然產物鴉膽子素D（BD）為研究工具，先通過CCK-8、活死細胞染色等表型技術明確其對HCC細胞增殖及HIF-1α的特異性抑制，再借助Seahorse細胞能量代謝分析、糖攝取/乳酸檢測等技術解析BD對HIF-1α介導糖代謝重編程的抑制效應；繼而運用DARTS、CETSA等技術篩選并聚焦靶點ICAT，結合MST和分子對接技術直接驗證BD與ICAT的結合及關鍵作用位點；隨后通過敲低ICAT、Co-IP等實驗技術，闡明 BD結合ICAT后破壞其與β-catenin的相互作用、促進β-catenin降解進而抑制HIF-1α 合成的調控鏈，且敲低ICAT的反向驗證進一步夯實ICAT的核心功能；最終借助 Huh7裸鼠移植瘤模型的體內實驗，結合瘤內蛋白表達檢測、組織學分析等技術閉環驗證機制，全程以DARTS、CETSA、MST等生物物理技術和Seahorse代謝分析為核心技術支撐，完整揭示BD通過“ICAT→β-catenin→HIF-1α”軸調控HCC代謝重編程的分子邏輯，為HCC代謝靶向治療提供了技術驅動的機制創新與藥物研發方向。

02. 主要研究內容

（1）ICAT是BD的直接靶點

為探究BD調控HIF-1α的分子靶點，本研究基于“小分子結合蛋白在蛋白水解過程中會被保護并富集”的原理，采用DARTS結合質譜的定量蛋白質組學策略篩選潛在直接結合蛋白，結合BD可抑制β-catenin及HCC中β-catenin與HIF-1α表達正相關的背景，優先聚焦β-catenin信號抑制因子ICAT；隨后通過CETSA證實，100 μmol/L BD 可提升HepG2、Huh7細胞中ICAT的熱穩定性；為明確結合類型與位點，經質譜分析排除BD與ICAT的共價結合后，通過分子對接預測到BD與ICAT的Lys28形成氫鍵，并與Leu24、Leu52、Met25存在疏水作用，進一步采用MST直接測定BD與野生型 ICAT的結合親和力（Kd≈33 μmol/L），且通過定點突變構建Lys28突變體后，MST顯示其結合親和力顯著降低（Kd≈250 μmol/L），最終從技術層面完整驗證ICAT是BD 的直接靶點，且Lys28為關鍵結合位點。

（2）BD靶向ICAT干擾β-catenin/HIF-1α軸抑制HCC糖代謝的機制

研究通過ICAT小干擾RNA（si-ICAT）敲低HepG2和Huh7細胞中的ICAT，發現其可顯著逆轉BD對HIF-1α及下游糖酵解相關蛋白（LDHA、GLUT1/3、HK2、PKM2）的抑制作用，同時緩解BD對HCC細胞糖攝取和L - 乳酸生成的抑制，證實 ICAT是BD調控β-catenin/HIF-1α通路及糖代謝的關鍵靶點。已知ICAT可阻斷β-catenin與TCF/LEF結合，還能通過競爭APC結合位點穩定β-catenin。進一步實驗顯示，BD在缺氧條件下劑量依賴性抑制β-catenin表達，且蛋白酶體抑制劑MG-132可逆轉該效應，提示BD通過蛋白酶體依賴途徑降解β-catenin。免疫共沉淀（Co-IP）實驗證實，BD可減弱ICAT過表達細胞中β-catenin與ICAT的直接結合，且β-catenin 敲低后HIF-1α表達顯著降低。為明確BD抑制HIF-1α的機制，MG-132處理顯示BD 可阻斷HIF-1α積累，蛋白翻譯抑制劑CHX表明BD不影響其降解速率，qRT-PCR證實HIF-1α mRNA水平無變化，說明BD通過抑制其蛋白翻譯發揮作用。綜上，BD直接靶向ICAT，干擾其與β-catenin的相互作用并促進后者降解，進而調控HIF-1α表達，為其抑制HCC糖代謝的機制提供了關鍵實驗依據。

（3）BD抑制異種移植瘤的生長

為評估BD的體內抗腫瘤活性，本研究構建Huh7細胞裸鼠皮下移植瘤模型，以 0.75 mg/kg/天和1.5 mg/kg/天的劑量對實驗小鼠進行連續兩周尾靜脈注射給藥。結果顯示，1.5 mg/kg/天的BD處理組可顯著抑制移植瘤生長，且所有給藥組小鼠均未出現明顯體重下降及副作用。對腫瘤組織的病理與免疫組織化學分析表明，1.5 mg/kg/天的BD處理可使腫瘤壞死面積顯著增加、TUNEL陽性細胞（凋亡細胞）增多，同時減少Ki67陽性細胞（增殖細胞）。與體外實驗結果一致，BD處理后瘤組織中HIF-1α、β-catenin、GLUT1/3、LDHA、ICAT及Cyt c的蛋白水平均顯著下調，進一步在體內驗證了BD通過調控“ICAT→β-catenin→HIF-1α”軸抑制HCC進展的作用。

03. 參考文獻

Huang R, Zhang LJ, Jin JM, et al. Bruceine D inhibits HIF-1α-mediated glucose metabolism in hepatocellular carcinoma by blocking ICAT/β-catenin interaction. Acta Pharm Sin B. 2021, 11(11):3481–3492. doi: 10.1016/j.apsb.2021.05.009