在果樹產業中，蘋果的市場競爭力不僅取決于產量，更與果實的營養品質和外觀特性緊密掛鉤。隨著消費者健康意識提升，抗壞血酸（維生素 C） 的抗氧化、增強免疫力功能，以及花青素的護色、延長貨架期與潛在保健價值，已成為衡量蘋果“優質性”的核心標準，也是育種企業與種植端追求的關鍵目標。如何通過分子層面的調控，實現這兩種物質的高效協同合成，始終是行業亟待突破的技術難點。

今天和大家分享一篇關于聚焦蘋果分子生物學與品質調控研究的文章，該文章于2025年1月發表在Plant Biotechnol J雜志上，標題為“The regulatory module MdCPCL‐MdILR3L mediates the synthesis of ascorbic acid and anthocyanin in apple”。

01. 研究思路

本研究以分子生物學技術為核心探究蘋果抗壞血酸（AsA）與花青素協同合成機制：針對普通蘋果果肉兩物質含量低的問題，選取含紅肉/非紅肉株系的新疆紅肉蘋果二代雜交群體為材料，經含量測定與基因關聯分析，發現紅肉株系AsA含量為非紅肉16倍，且與 MdGLDH表達（r=0.94）、花青素含量（r=0.90）強相關，鎖定MdGLDH為關鍵基因；隨后以MdGLDH啟動子為誘餌，通過酵母單雜交（Y1H） 篩選到R3型 MYB 轉錄因子 MdCPCL，結合生物信息學分析確認其核定位特征，再經EMSA和ChIP技術證實其可特異性結合MdGLDH啟動子MBS元件，雙熒光素酶報告（LUC）實驗驗證其轉錄激活作用；接著通過CRISPR/Cas9 基因編輯構建MdCPCL敲低愈傷，結合過表達載體與果實瞬時實驗，雙向驗證MdCPCL正向調控兩物質合成；最后經酵母雙雜交（Y2H）篩選到互作的 bHLH因子MdILR3L，pull-down、LCI、BiFC技術證實體內外互作，且MdILR3L可增強 MdCPCL 與MdGLDH、MdANS啟動子的結合及激活能力，最終構建復合體調控模型，為蘋果品質育種提供靶點。

02. 主要研究內容

（1）R3型MYB轉錄因子MdCPCL與MdGLDH啟動子的結合機制

為明確R3型MYB轉錄因子MdCPCL與抗壞血酸合成關鍵酶基因MdGLDH啟動子的相互作用，研究人員首先以MdGLDH啟動子為誘餌，經酵母單雜交（Y1H）篩選鑒定出 MdCPCL且共轉化MdCPCL-AD與proMdGLDH-pHIS2的Y187酵母細胞可在含60 mM 3-AT的- T-H-L選擇性培養基上生長，初步證實二者結合；接著通過順式作用元件分析發現 MdGLDH啟動子含4個MYB結合位點（MBS），再經凝膠阻滯實驗（EMSA）進一步驗證MdCPCL可特異性結合其中2 個MBS元件，且競爭探針會降低結合強度、突變探針則完全消除結合，明確結合的序列特異性；隨后在轉基因 “王林” 蘋果愈傷組織中，利用染色質免疫沉淀（ChIP）實驗富集到含MBS元件的MdGLDH啟動子片段，證實體內結合關系；最后通過熒光素酶報告基因（LUC）實驗發現，MdCPCL能顯著激活MdGLDH啟動子活性（P<0.05）并促進其轉錄。同時，生物信息學分析顯示MdCPCL含高度保守的SANT 結構域（推測為 DNA 結合關鍵模塊）、與PbCPCL1同源性高且定位于細胞核，上述多技術協同證明MdCPCL通過SANT結構域特異性結合MdGLDH啟動子MBS元件并激活其轉錄，為解析蘋果抗壞血酸合成調控機制提供關鍵依據。

（2）MdCPCL 直接結合花青素合成途徑中結構基因MdANS的啟動子

鑒于MdCPCL過表達愈傷組織中MdANS和MdUFGT的表達量顯著升高，我們推測 MdCPCL可能與MdANS和MdUFGT的啟動子存在相互作用。酵母單雜交（Y1H）實驗顯示，共轉化MdCPCL-AD與proMdANS-pHIS2的Y187感受態細胞能在含80 mM 3-AT的 - T-H-L 選擇性培養基上生長；而MdCPCL-AD與proMdUFGT-pHIS2共轉化細胞未檢測到相互作用。對MdANS啟動子的進一步分析發現其含有兩個MYB轉錄因子結合元件。為驗證MdCPCL與MdANS啟動子的相互作用，我們進行了凝膠阻滯實驗（EMSA），結果顯示MdCPCL可結合MBS順式元件，且隨著競爭探針濃度增加，結合能力逐漸減弱；當標記探針替換為突變探針時，未檢測到結合信號。此外，熒光素酶報告基因（LUC）實驗證實MdCPCL能顯著激活MdANS啟動子。染色質免疫沉淀（ChIP）實驗也證明了二者的結合，在MdCPCL-GFP轉基因"王林"愈傷組織中，含MBS順式元件的MdANS啟動子片段被特異性富集。

（3）MdCPCL 與 MdILR3L 在體內外的相互作用

通過酵母雙雜交（Y2H）篩選，鑒定出一個bHLH轉錄因子MdILR3L。MdILR3L的編碼序列（CDS）可翻譯生成含238個氨基酸的蛋白質。同源片段分析和氨基酸序列比對證實，MdILR3L含有高度保守的HLH結構域，且其轉錄產物在細胞核中表達。酵母雙雜交實驗進一步證實了MdCPCL與MdILR3L之間的相互作用。下拉實驗（pull-down）顯示，利用抗GST抗體進行的蛋白質印跡分析能成功檢測到MdCPCL-GST，但無法檢測到單獨的 GST，這表明MdILR3L-HIS可下拉MdCPCL-GST而非GST，證實了二者在體外的相互作用，反向驗證結果一致。煙草葉片中的熒光素酶互補成像（LCI）實驗顯示，共表達 MdCPCL-cLUC與MdILR3L-nLUC產生的熒光信號顯著強于對照。此外，雙分子熒光互補實驗（BiFC）顯示，共轉化35S:MdCPCL-CYFP與35S:MdILR3L-NYFP的煙草葉片表皮細胞中可觀察到YFP熒光，而共轉化35S:MdCPCL-CYFP與35S:NYFP或35S:MdILR3L-NYFP與 35S:CYFP的細胞中未檢測到YFP熒光，表明MdCPCL與MdILR3L在體內存在相互作用。

（4）MdCPCL-MdILR3L 復合體促進蘋果中抗壞血酸（AsA）和花青素的合成

鑒于MdCPCL與MdILR3L可形成異源二聚體，研究人員進一步研究了該復合體是否影響抗壞血酸（AsA）和花青素的合成。將MdCPCL與MdILR3L共轉化至"王林"蘋果愈傷組織中，獲得了3個獨立的穩定轉基因株系。通過不同標記抗體檢測、RT-qPCR 分析及序列鑒定，證實了轉基因的存在。在光照培養條件下，共轉化愈傷組織中抗壞血酸和花青素的積累量以及MdGLDH和MdANS基因的相對表達量均高于單獨過表達MdCPCL的愈傷組織，表明MdCPCL-MdILR3L復合體可進一步促進抗壞血酸和花青素的積累。為探究該復合體對MdGLDH和MdANS啟動子的影響，我們進行了EMSA實驗，結果顯示添加 MdILR3L-GST后，MdCPCL與MdGLDH和MdANS啟動子的結合強度顯著增強，表明該復合體可增強與下游基因啟動子的結合能力。此外，熒光素酶報告基因（LUC）實驗顯示，proGLDH/proANS::LUC與35S::CPCL和35S::ILR3L共表達時的發光強度高于 proGLDH/proANS::LUC與35S::CPCL單獨共表達的情況。這些結果表明，MdCPCL與 MdILR3L相互作用可促進下游基因的轉錄，從而增加抗壞血酸和花青素的積累。

03. 參考文獻