非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌病例的85%，是肺癌領域的“致命挑戰”，因早期診斷困難、晚期耐藥頻發導致患者5年生存率長期處于低位；盡管靶向治療、免疫治療等療法不斷進階，但腫瘤異質性引發的療效差異、耐藥反復等問題，仍使臨床對新型治療機制與藥物需求迫切。而MicroRNA（miRNA）作為基因表達調控的關鍵分子，在腫瘤發生發展中扮演“分子開關”角色，其中miR-145-5p是公認的抑癌miRNA，可通過靶向致癌基因抑制NSCLC細胞增殖，卻因在腫瘤微環境中易被降解、穩定性不足嚴重限制功能發揮，因此如何保護這類抑癌miRNA的活性，成為肺癌研究的新突破口。

今天和大家分享一篇關于聚焦天然產物欖香烯（Elemene）在非小細胞肺癌（NSCLC）治療中作用機制研究的文章，該文章于2024年10月發表在J Pharm Anal雜志上，標題為“Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer”。

01. 研究思路

本文圍繞“闡明欖香烯抗非小細胞肺癌（NSCLC）的分子機制”展開：首先，通過患者來源異種移植（PDX）模型、細胞來源異種移植（CDX）模型，結合A549、H460等細胞系的體外實驗，運用CCK-8法、流式細胞術、Western blot等技術，證實欖香烯可抑制NSCLC生長，并鎖定NF-κB炎癥通路為核心作用通路；其次，借助高通量miRNA測序技術篩選差異表達miRNA，結合OncomiR、dbDEMC等數據庫交叉驗證，再通過qRT-PCR、Northern blot技術驗證，確定miR-145-5p是介導欖香烯作用的關鍵靶點；接著，利用miRTarBase、TargetScan等生物信息學工具篩選靶基因，通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-145-5p直接結合MAP3K3的3'-UTR，再以Western blot、qRT-PCR技術驗證二者的調控關系及對NF-κB通路的影響；隨后，采用qRT-PCR、Northern blot、放線菌素D實驗明確欖香烯通過抑制miR-145-5p降解（而非影響其合成）來提高其穩定性，通過微量熱泳動（MST）技術測定結合親和力（KD=0.39±0.17 μg/mL），結合分子對接技術闡明欖香烯結合miR-145-5p 3' 端胞嘧啶的作用模式；最后，通過慢病毒介導構建miR-145-5p過表達 / 敲低的穩定細胞系，開展體內外rescue實驗，并結合免疫組化（IHC）技術，驗證“欖香烯→miR-145-5p→MAP3K3→NF-κB”通路的特異性。全程以多維度技術手段系統揭示了欖香烯抗NSCLC的分子機制，為天然產物靶向miRNA的藥物研發提供了新思路。

02. 主要研究內容

（1）欖香烯體外抑制非小細胞肺癌（NSCLC）細胞增殖

為明確欖香烯對非小細胞肺癌（NSCLC）的體外作用機制，研究以A549、H460 等細胞系為對象，經不同濃度欖香烯處理后，通過CCK-8法檢測到細胞活力呈劑量依賴性顯著下降，菌落形成實驗進一步證實其抑制腫瘤細胞增殖（菌落數量與體積減少）。借助流式細胞術結合Western blot，發現欖香烯可誘導細胞周期S期阻滯（S期相關蛋白表達降低）；通過流式細胞術（Annexin V-FITC/PI雙染色） 和免疫熒光成像，證實其提高凋亡率并觸發細胞色素C釋放，且Western blot檢測到促凋亡蛋白上調、抗凋亡蛋白下調。劃痕愈合實驗與Western blot表明，欖香烯能抑制細胞遷移（遷移相關蛋白表達降低）。為驗證通路參與，Western blot顯示其降低IKKα/β、IκBα磷酸化水平，免疫熒光成像與Western blot證實抑制p65/p50核轉位，GST pull-down和ChIP實驗表明其減少p65/p50與COX-2啟動子結合，最終Western blot檢測到NF-κB下游炎癥因子表達降低。綜上，多技術協同證實欖香烯通過抑制增殖遷移、誘導周期阻滯與凋亡、調控NF-κB通路，顯著抑制NSCLC細胞進展。

（2）欖香烯通過一種依賴于調控miR-145-5p的機制發揮其抗腫瘤作用

通過Western blot分析和qRT-PCR在細胞來源異種移植（CDX）模型、患者來源異種移植（PDX）模型及A549細胞系中證實其顯著抑制MAP3K3的蛋白和mRNA 表達，再借助雙熒光素酶報告實驗和Western blot分析明確miR-145-5p可顯著干擾欖香烯對MAP3K3的調控作用，通過菌落形成實驗觀察到miR-145-5p水平降低時，欖香烯誘導的菌落形成能力下降現象被部分逆轉，證實欖香烯對體外腫瘤細胞生長的抑制依賴于miR-145-5p，提示其通過調控miR-145-5p/MAP3K3/NF-κB信號軸發揮抗癌作用；后續通過慢病毒介導的穩定細胞系構建（表達LV-anti-miR-145-5p或 LV-anti-miR-NC），在裸鼠體內構建NSCLC模型，發現miR-145-5p敲低組中欖香烯的抗腫瘤效能顯著降低，再經Western blot分析檢測到體內敲低miR-145-5p可緩解 MAP3K3表達降低、提高NF-κB信號通路活性并逆轉欖香烯對COX-2、IL-6、TNF-α 等蛋白的下調作用，最終通過免疫組化（IHC）實驗驗證上述結論，明確欖香烯抑制非小細胞肺癌（NSCLC）進展的作用至少部分由miR-145-5p介導。

(3) 欖香烯通過阻斷miR-145-5p的降解來增加其豐度

欖香烯通過直接結合miR-145-5p阻斷其降解，進而增加該miRNA的豐度：首先借助qRT-PCR技術分析欖香烯處理后成熟miR-145-5p及其前體（pri-/pre-miR-145-5p）的濃度，證實其僅顯著提高成熟miR-145-5p的豐度；隨后通過Northern blot實驗進一步驗證，明確欖香烯僅特異性升高成熟miR-145-5p水平，對其前體無影響，從而排除了通過調控生物合成增加豐度的可能性。為明確欖香烯對miR-145-5p的降解抑制作用，在RNA合成抑制劑放線菌素D存在的條件下進行穩定性實驗，結果證實欖香烯能有效阻斷miR-145-5p的降解。細胞裂解物共孵育實驗顯示，預先與欖香烯孵育的miR-145-5p降解程度顯著降低，但miR-145-5p與經欖香烯預處理的細胞裂解物共孵育時，降解無明顯變化，這表明欖香烯是通過直接結合miR-145-5p發揮穩定作用，而非抑制RNA降解酶的活性。進一步通過分子對接技術模擬二者相互作用，發現欖香烯優先結合miR-145-5p的3'端，通過非極性范德華力與該區域 C20?C22位的胞嘧啶結合。最后，微量熱泳動（MST）技術測定結果顯示，野生型 miR-145-5p與欖香烯的解離常數（KD=0.39±0.17 μg/mL）遠低于突變體。綜上，欖香烯在不改變miR-145-5p生物合成途徑的前提下，通過直接結合增強其穩定性，最終實現miR-145-5p豐度的增加。

03. 參考文獻

Zhou MR, Wang JY, Peng YL, et al. Elemene as a binding stabilizer of microRNA-145-5p suppresses the growth of non-small cell lung cancer. J Pharm Anal. 2024, 15(3):101118. Doi: doi.org/10.1016/j.jpha.2024.101118